实验原理
RNA可以使用非变性或变性琼脂糖凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中,虽然可以分离混合物中不同分子量的RNA分子,但是无法确定分子量,主要是RNA分子存在二、三级结构二影响其电泳结果。只有在变性情况下,RNA分子完全伸展,其泳动率才与分子量成正比。因此电泳时应在变性剂存在下进行,常用的变性剂为甲醛或戊二醛。
实验步骤
1.将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。
2.制胶:称取0.25g琼脂糖,加入放有18.3ml的DEPC水的锥形瓶中,加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入2.5ml的10×电泳缓冲液、4.25ml的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶,插好梳子,水平放置待凝固后使用
3.加样:将凝固后的甲醛琼脂糖凝胶从制胶槽转移至电泳槽,加入电泳缓冲液待上样。在一个洁净的小离心管中混合以下试剂:电泳缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺10μl、RNA样品3.5μl。混匀,至60℃保温10分钟,冰上速冷。加入3μl、的上样缓冲液混匀,取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。
4.电泳:连接电源线,打开电泳仪,稳压5V/cm电泳。
5.观察电泳结果:当指示剂电泳至胶中部即可结束电泳,通过紫外分析仪,对电泳胶进行观察和照相,记录实验结果。
6.分析电泳结果:记录所观察的电泳图谱,注意每条带的相对位置及浓淡情况等。在正常情况下,紫外灯下可见28S、18S和5S rRNA三条带,观察28S和18S二条带是否清晰,若28S的荧光强度为18S的二倍以上,则说明RNA分子没有降解。
注意事项
1.实验中必须防止RNase污染以免RNA降解。
2.所有试剂用DEPC水配制,用具也用DEPC水冲洗,并蒸汽灭菌。