双位点一步法的应用
适用于双抗体夹心法的Elisa试剂盒，有些也可用双位点一步法检测。如HBsAg同样可用此法进行检测，其原理为：将纯化的抗HBs吸附于固相载体表面，加入待检血清(或血浆)，同时加入辣根过氧化物酶标记的另一个抗HBs(酶结合物)，如血清或血浆中含有HBsAg，则通过温育形成固相McAb-HBsAg-酶标McAb复合物，加入底物，通过显色反应进行测定。若血清或血浆中不含HBsAg，通过洗涤除去未结合物，加底物后就不显色。由于应用McAb，双位点一步法具有很高特异性，一步法省时、简便。
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
双位点一步法的操作步骤
1、将1个McAb与固相载体连接，形成固相McAb。洗涤除去未结合物。
2、同时加入待检标本和酶标McAb，温育，是待检抗原和固相McAb及酶标McAb反应形成双抗体夹心复合物。洗涤除去未结合物。
3、加底物显色。
双位点一步法注意事项
当待检抗原浓度过高时，大量过剩抗原分别饱和固相McAb和酶标McAb而抑制夹心复合物的形成，这种现象称为钩状效应(hook effect)，可出现假阴性结果。可将待检标本稀释后再做或提高抗体试剂的亲和力、浓度、纯度定以消除钩状效应。
Elisa试剂盒双位点一步法应用识别抗原不同位点2个单克隆抗体(McAb)作双抗体夹心法测定。包被一个McAb后，同时加入待检抗原和另一个McAb酶标物，待检抗原上的2个抗原决定簇同时与固相McAb和酶标McAb结合，形成固相McAb-待检抗原-酶标McAb复合物，加底物通过显色反应进行测定。