从字面上来说，酶联免疫斑点检测（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISPOT）可以分解成“酶联免疫”和“斑点”两部分。“酶联免疫”与ELISA中的含义相同，都是指基于酶促放大反应的免疫学检测。与ELISA一样，ELISPOT的抗体也是包被于固体载体上，所不同的是：ELISA抗体捕获的抗原来自样品溶液中已经存在的、均匀分布的抗原分子，而ELISAPOT抗体捕获的抗原来自样品细胞在检测当时新鲜分泌的抗原分子；ELISA显示出来的是或深或浅的有色溶液，而ELISAPOT显示出来的是沉积在固体基板上或多或少的有色斑点，这也是ELISPOT一词中“斑点”的来历。
ELISA检测的是无生命的溶液中抗原分子的浓度，ELISPOT检测的是有生命的活细胞分泌抗原的功能。即将不同来源的一定量的细胞加至已包被抗细胞因子抗体的固相微孔板内，同时加入细胞刺激剂，经培养一定时间，洗去细胞，再加入酶标抗体，与被测细胞分泌的细胞因子反应，最终通过ELISPOT检测仪读取斑点数。此法可测定一定属灵的细胞所分泌的细胞因子的量。
试剂与器材
实验培养器材：超净工作台、5%CO2，37℃细胞培养箱等。
ELISPOT试剂盒：包括包被抗体、检测抗体、亲和素、封闭液、稀释缓冲液R（10×）、Tween20、显色液存储液以及胶囊等。
Biosys Bioreader 4000 PRO自动读板仪。
P20，P200，P1000微量移液器及枪头。
0.5ml及1.5ml Eppendorf管。
抗原或促有丝分裂原。
操作步骤
未包被板ELISPOT技术主要包括抗体包被、细胞加板和斑点显色三大步骤。
一、抗体包被
1、润湿：在未包被ELISPOT板每孔中加入15μl包被缓冲液预湿。
2、包被：润湿之后，无需洗涤。每孔加入50μl PBS稀释好的包被抗体（浓度为10μg/ml），4℃包被过夜。
3、封闭：次日倾倒包被液，用PBS洗涤2次。最后一次，在灭菌的吸水纸上拍干。200μl/孔加入用1×PBS稀释好的封闭液，37℃封闭1h或室温封闭2h。
4、倾倒封闭液，无需洗涤，直接加入检测细胞进行ELISPOT检测。
二、细胞加板
1、取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前封闭的板，先加入200μl RPMI-1640培养基室温静置10min，然后倾倒。
2、细胞加板：按照实验设计，接种不同浓度的细胞，100μl/孔，每一样本建议做双复孔。同时设阳性对照和阴性对照。
3、加刺激物：把刺激物配成10×工作液，实验孔每孔加入10μl。阳性对照孔加入10μl PHA，终浓度1-4μg/ml，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。阴性对照孔不加任何刺激物。
4、加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱看，37℃培养 18-24h。
注意以上步骤均应无菌操作
三、斑点显色
1、裂解细胞：倾倒孔内的细胞及培养基，每孔加入冰冷的去离子水200μl，4℃ 冰浴10min（低渗裂解细胞）。
2、洗涤：每孔加入200μl PBST，洗涤5次，最后一次，在吸水纸上扣干。
3、加检测抗体：每孔加入100μl稀释好的生物素标记检测抗体，37℃孵育1h。
4、同2进行洗涤。
5、加酶标亲和素：每孔加入100μl稀释好的酶标亲和素，37℃孵育1h。
6、同2进行洗涤。
7、显色：用100ml 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊，然后加入3.3ml AEC储存液，混合均匀后立即分装，每支10ml，-20℃保存。每孔加入100μl的显色液，室温或者37℃ 静置15-45min（在20-25℃显色25min或者37℃显色15min较合适），注意避光。
8、洗涤晾干：待斑点生长到合适的大小之后，以去离子水洗涤2编，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后去下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜自然晾干。注意不要将板放在烤箱内，防止膜发脆、破裂。
9、将ELISPOT板置于Biosys Bioreader 4000 PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。
注意事项
1、细胞加入前应彻底洗干净，避免带入外源性细胞因子。
2、加板时细胞在孔中的分布要尽量均匀，要诀是加入细胞之后，不要再振动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况恰恰相反。同样加完刺激物后也不要在拍击ELISPOT板。
3、ELISPOT是通过计数形成的斑点数来判定结果，斑点数的多少应该能真实反映实验对象的客观情况。为了使实验的统计学意义显著，斑点数目不宜太少；但为了使实验结果便于计数，斑点数目也不宜太多。一般来说，实验孔的斑点数目。而对照孔的斑点数目应该越少越好，最好不要超过10ge，否则要提高检测细胞的质量，让细胞保持较好的状态与活力。