间接法的原理
标本中的待检抗体与固相抗原结合后，利用酶标与抗体（抗人Ig）进行检测。
测定抗体的简接ELISA法。病原体或其他外源大分子物质进入机体后都可能刺激机体产生相应的抗体，所以可以通过检测某种病原体的相应抗体来判断机体是否曾经被某种病原体所感染，达到诊断的目的。
间接法是测定抗体最常用的方法。该方法首先将已知定量的抗原（如某个病原体的蛋白质）吸附（也称包被）与固相载体（微孔滴定板的微孔内），加入待检测的样品（如病人血清含相应抗体为第一抗体）与之结合。温育反应一定时间。此时，如果血清中含有该病原体蛋白质的抗体（第一抗体）时，则该抗体与固相抗原发生特异性结合，然后，加入酶标抗球蛋白抗体（第二抗体即酶标抗抗体，如血清为人血清，则加入抗人抗体的抗体），该酶标抗抗体就与已知固相抗原结合的第一抗体结合，形成抗原—抗体—酶标第二抗体的复合物，同样保温、洗涤后加入无色的酶底物，保温一定时间进行酶促反应，酶催化底物显色，观察反应后颜色的有无及深浅来判断反应结果。若有颜色反应，说明检测样品中含有相应的抗体，所以是阳性反应。根据颜色深浅，还可以进行定量分析。反之，若无色，说明样品中无相应抗体，为阴性反应。
间接法的操作步骤
1、包被固相载体：用已知抗原包被固相载体，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原和杂质；
2、封闭：用高浓度无关蛋白封闭，阻止待检血清中非特异IgG吸附固相；
3、加待检样本：经过温育（37℃ 2h），使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质；
4、加酶标抗抗体或酶标SPA：再次温育（37℃ 2h），使酶标抗抗体与 固相载体上抗原抗体复合物结合，形成固相抗原—待检抗体—酶标抗抗体（酶标SPA）复合物；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体；
5、加底物显色：温育（37℃ 30min）；
6、终止反应判定结果，目测定性或用酶标仪测光密度进行定量分析。
间接法的方法评价
酶联免疫间接法是检测抗体最常用的方法，应用广泛，敏感，应用一种酶标抗抗体可以用于检测一个种系内各种抗原的相应抗体。
间接法的应用
间接ELISA法主要用于抗体的检测。运用此法可以检测：人类免疫缺陷病毒HIV（-1/2）抗体，丙型肝炎病毒抗体（抗HCV），戊肝抗体（抗HEV），庚肝抗体（抗HGV）等。以检测丙型肝炎病毒抗体为例，如下：
检测丙型肝炎病毒的适应症为：用于检测血清或血浆中丙型肝炎抗体，供献血员筛选机临床辅助诊断。其原理为：将HCV结构区核心蛋白和非结构区蛋白的混合抗原包被于微孔条，样品加到固相抗原板上，当样品中含有HCV特异性抗体（第一抗体时），则该抗体与固相抗原发生特异性结合，然后加入过氧化物酶标记的抗人（IgG），则该抗体与固相抗原发生特异性结合，然后加入过氧化物酶标记的抗人IgG抗体（第二抗体），该酶标抗体就与已和固相抗原结合的第一抗体结合，形成抗原—抗体—酶标第二抗体的复合物，再加底物，酶催化底物显色。在因性反应中，因样品中不含HCV的抗体，酶标抗体不能与之结合，故无颜色变化。